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转基因辣椒PCR检测方法

 论文栏目:转基因论文     更新时间:2019/3/14 19:07:18   

辣椒是人们生活中必不可少的蔬菜作物,具有药理、经济、食用、营养等方面的价值。我国辣椒制品种类繁多,如油辣椒、糟辣椒、辣椒酱等,辣椒制品的多样化推动了我国辣椒产业经济的发展。辣椒在世界各地广泛种植,但同时也面临着连作障碍、土壤传播疫病、生长条件、产量及质量等诸多问题,人们借助转基因技术以及辣椒分子育种技术,对辣椒的生长条件、栽培技术、病虫害}坊治等方面进行了研究,‘一zlo随着转基因作物及其产品的大规模商业化,越来越多的转基因农产品被制作成为人类消费的食品,转基因食品在传统食品市场中的份额正不断加大,逐步走上餐桌,进人人们的食物链。由于其安全性及对人类健康和生态环境的潜在威胁受到国际社会和广大民众的广泛关注,s1,作物转基因成分的检测越来越受到重视lal目前,对于转基因成分检测主要是针对重组DNA的核酸检测,如聚合酶链式反h以PCR),包括定性YCR、多重YCR和实时荧光YCR等。其中,实时荧光YCR作为目前主要的检测方法,有效避免了普通YCR方法存在的检测灵敏度不高、费时且容易造成交叉污染等缺点,确保了检测结果的快速、准确I>-HI本文通过)a:用实时荧光YCR技术对抗CMV(Cucumbermosaicvirus,黄瓜花叶病毒)转基因辣椒进行检测,旨在建立一种简便、快速的辣椒转基因成分检测方法,以期为消费者食品安全及我国农业转基因生物的监管提供有力的技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料与仪器1.1.1材料转基因辣椒阳性标准物质,非转基因辣椒,非转基因土米、大豆、水稻、油菜籽、番茄。1.1.2试剂。YremixEx`faq(YroheqYCR)(荧光YCR反):液)、MiniBESTUniversalGenomioDNAExtractionKit(DNA提取试剂)、弓{物及`faqMan探针,均购买于宝日医生物技术有限公司。1.1.3仪器。实时荧光YCR仪(7500Fast,美国AppliedBio-systems,高速冷冻离心机(Miorofuge22RCentrifuge,美国BeckmanCoulter}、超纯水仪(Milli-Q,美国Milli-pore、核酸蛋白测定仪(NanoDrop2000,美国`fhermoScientific)、冷冻研磨仪(MM400,德国Retsoh),移液器、涡旋振荡器、‘恒温金属浴、生物安全柜等。1.1.4引物及探针。根据GenBank中转基因辣椒的C}}lTL1(CapsicumannuumAT-hooklgene,编码辣椒A`f-hook1蛋白基因)和CMV基因序列,利用PrimerExpres*软件设计引物和`faqMan探针序列,弓{物和探针序列及扩增长度见表1,探针和引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。1.2试验方法1.2.1DNA提取。取2%C`fAB抽提缓冲液于65℃金属浴中预热,取样品约0.39置于冷冻研磨仪(液氮处理)研磨,加人2%C`fAB抽提缓冲液700p,L,轻轻搅动,将磨碎液倒人1.5mL火菌离心管中,于65℃金属浴加热振荡10min,加人5mol/L醋酸钾溶液5p,L,混匀,再金属浴20min;取出离心管后放置在冰上,加人等体积的氯仿/异戊醇(24:1),轻轻来回颠倒,充分混匀;然后放人4℃高速冷冻离心机中(12000r/min)离心15min,吸取上清液500p,L放人另一离心管中,加人等体积的异戊醇,颠倒混匀;12000r/min离心10min后,弃上清,加人75%乙醇500p,L,轻弹离心管,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中,放置30min,使DNA块状物上的不纯物溶解;12000r/min离心5min后弃去上清,加人等量75%乙醇再洗30min,12000r/min离心5min后,弃上清液,并将离心管倒立于滤纸之上,自然风千,加人50O,L`1'E溶液,使DNA溶解,利用核酸蛋白测定仪测定样品DNA的OD_},。与OD_}},其余于一20℃冰箱冷冻保存、待用。1.2.2荧光YCR反):体系。实时荧光YCR使用商品化专用荧光YCR反):液Premix};x`1'aq}n'(内含经优化过的laq酶、Mg',dN1P);反):体系中的引物和`1'aqMan探针使用推荐浓度,具体见表201.2.3荧光YCR反办、:程序。根据引物及`1'aqMan探针Tm值,确定荧光YCR反):的最佳反):程序,见表30标准品有明显扩增曲线,其余对照物则没有。结果表明,针对内源基因C}zATLl和外源基因CMV的检测引物和探针具有较好的特异性。2.3灵敏度试验结果测定阳性标准品DNA浓度为240ng/N,L,并对其进行10倍梯度稀释,用上述反):体系和程序进行实时荧光YCR检测,确定检测灵敏度。由图2可知,内源基因C}zATLl和外源基因CMV到了1.2.4特异性试验。以转基因辣椒阳性标准品以及非转基因辣椒、土米、大豆、水稻、油菜籽、番茄的基因组DNA为模板,进行实时荧光YCR检测,确定内源基因引物GzATLl和外源基因引物CMV的特异性。1.2.5灵敏度试验。测定转基因辣椒阳性标准品DNA浓度,并对其进行10倍梯度稀释,稀释10个梯度,将稀释液用上述反):体系和程序进行实时荧光YCR检测,确定检测灵敏度。

2结果与分析

2.1DNA提取结果提取样品总DNA,利用核酸蛋白测定仪测定样品DNA的浓度与纯度,DNA质量浓度可以达到100--200ng/N,L,OD_},/OD_}}。值在1.6--1.8Z问,均达到后续试验对DNA进行分析的要求。2.2特异性试验结果以转基因辣椒阳性标准品以及非转基因辣椒、土米、大豆、水稻、油菜籽、番茄的基因组DNA为模板,进行实时荧光YCR检测。由图1可知,针对内源基因C}}1TLl,只有转基因辣椒阳性标准品和非转基因辣椒有明显扩增曲线,而其他对照物则无扩增曲线;针对外源基因CMV,只有转基因辣椒阳性10-稀释度((0.01%)仍然可以检测出来,形成典i}J的“S"形扩增曲线。其中,内源基因C}}1TL1在10}稀释度有非典型的扩增曲线(C`1'值>>35),在进行10次重复测试后,发现10-}稀释度扩增曲线呈现不稳定态势,表明该稀释度下的DNA含量极低,已达到方法检测极限,容易出现波动,故将其灵敏度取10-稀释度((0.01%)。

3结论与讨论

在分子生物学的标准上,判断DNA纯度的依据是OD_6}/OD_},。的比值,符合要求纯度高的纯化DNA其OD_},/OD_},。在1.7--1.9}问,低于此范围表示所提取的样品DNA中含有蛋白质污染,高于此范围表明样品DNA中有RNA污染。提取的辣椒样品DNA中存在着较多的多酚、多糖,也是导致OD_6}OD_}}。比值偏低的原因之一。因此,在操作的过程中,需要注意多糖、多酚杂质的去除,y_,叱特异性试验结果表明,针对辣椒内源基因C}}1TL1和外源基因CMV的检测引物和探针具有较好的特异性;灵敏度测试结果表明,转基因辣椒实时荧光YCR的灵敏度小于0.01%。目前,国际上设定的转基因限量大多为1%,是本方法检测灵敏度的100倍,认为0.01%的检测灵敏度已完全能够满足基因检测的需要。

作者:罗阿东 王丽平 任艳玲 蔡秋 王艳 单位:贵阳海关 贵州医科大学 贵州轻工职业技术学院

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