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Array Tomography技术在生命科学的应用

 论文栏目:生命科学论文     更新时间:2018/11/5 15:25:50   

【摘要】Arraytomography是一种基于连续超薄切片方法的高分辨率组织三维成像技术,可将Z轴分辨率提高到50nm,并可以进行多重荧光染色和扫描电镜观察。近年来,该技术和膜片钳、超高分辨率显微技术等联合使用,在生物组织精细结构和功能研究中得到了广泛的应用。

长久以来,免疫荧光显微镜成像、免疫电子显微镜成像以及基因编码的荧光蛋白标记是生命科学研究中最主要的成像技术。虽然这些技术功能强大、被广泛使用,但是每种技术都存在自身的缺点,从而导致很多重要的细胞和组织分子结构无法彻底明确。免疫荧光显微镜成像技术可以使用大量荧光染料,从而成为使用最广泛的成像技术之一。但是这一技术在分辨率和定量分析能力上存在缺陷,特别是在面对抗体渗透力较差的组织材料时尤其明显。免疫电子显微镜成像技术解决了免疫荧光显微成像在分辨率方面的缺陷,是目前分辨率最高的成像方法,用于观察最精细的分子结构。但是免疫电子显微镜的三维重构却由于工作量大,定位困难的原因而难于实现,并且免疫电镜无法使用荧光染料,限制了荧光多重标记技术的应用。2007年,斯坦福大学的Micheva和Smith将上述两种成像技术的优势结合在一起,发明了一种新的成像技术,基于连续超薄切片方法的高分辨率组织[1]三维成像技术-ArrayTomography(AT)。

实验中研究人员使用丙烯酸树脂LRWhite包被固定和脱水后的样品,这种树脂操作简单,亲水性有利于荧光标记和对GFP荧光的保护作用。他们将树脂包埋的组织切成50~500nm的连续切片,将连续组织超薄和半薄切片贴附在载玻片上,顺序用抗体进行标记,同一组织上可以检测十种抗原信号。对连续切片进行多重抗体标记后,使用激光共聚焦显微镜采集图像,经过计算机软件对图像进行二维拼接和三维重构,最后还可以使用扫描电镜采集背散射电子图像,电镜图像可以和之前的荧光标记图像联合观察(图1)。结果显示:AT技术获得了比激光共聚焦显微镜更高的分辨率。激光共聚焦显微镜采用光学切片技术,其分辨率在X/Y方向约为250nm,而Z轴的分辨[2]率约为700nm,实际成像分辨率则在1μm以上。AT采用物理切片方法,Z轴的分辨率最高可以达到50nm。并且,AT使用了超薄切片技术(50~200nm),使得抗体更容易渗透到组织内部,从而克服了普通薄切片(8~10μm)抗体渗透不足的缺点,获得了空间内均一、可靠的蛋白质定量信息。AT中使用的LRWhite树脂对抗体和抗原的相互识别没有影响。实验中,研究者尝试了29种神经生物学研究中常用的一抗,发现树脂包埋对免疫反应毫无影响,且只需要对组织进行多聚甲醛固定即可,极大地简化了样品处理过程。同时,在图像采集过程中很少发生明显的光漂白现象,可以反复对样品进行拍照。并且,AT方法对转基因动物携带的荧光蛋白成像也无影响。AT可以形成完整清晰的3D图像。AT中免疫标记后,采集每张切片同一位置的荧光图像,将图像排列重组形成3D图像。AT可以在同一样品上使用多种不同抗体连续进行标记,不同抗体之间无影响。实验中在同一样品上连续使用10种不同抗体进行免疫标记,均得到了满意的效果。并且在同一样品上使用同一种抗体连续进行6次免疫标记反应,每次反应的结果都显示出了相似的荧光标记强度,具有很好的重复性。AT免疫标记后,还可以对样品进行扫描电镜分析。要实现此功能需要在组织固定步骤时使用多聚甲醛/戊二醛前固定和锇酸后固定,电镜检测前使用醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色即可。结果显示,免疫标记过程不会对样品的超微结构产生影响。AT技术建立后得到了广泛的应用。Smith(2007)精细描绘了小鼠脑皮质层树枝状结构和树突棘以及[3]脑的神经环路。2010年,研究者对已标记的小鼠脑组织进行连续半薄切片和实时成像,获得小鼠全脑[4]的高分辨三维结构,该成果发表在Science上。Kirschmann等(2010)利用神经示踪剂和AT技术研究了鸣禽发声核团HVC中投射神经元之间的突触接[5]连。

Soiza-Reilly和Commons(2011)获得了小鼠脑[6]中缝背核的谷氨酸在三维空间里分布的定量结果。2012年,Saatchi等(2012)解析了腹主动脉瘤小鼠模型中,肿瘤血管壁微结构和细胞形态的三维空间[7]结构。吕春梅等(2013)对人正常结肠组织和小鼠肝脏进行高分辨成像分析,获得比传统显微镜更高的分辨效果和更丰富的结构细节。同时,她们结合多重抗体染色方法,对小鼠脑组织微管蛋白的分布[8]进行了高分辨三维成像。近些年来,研究者进一步将AT技术与其他技术联合使用,为科研问题的解决提供新的思路和方法。Valenzuela等(2016)将AT技术与电生理技术结[9]合在一起,首先对培养的小鼠脑片海马CA3区突触前神经元和突触后神经元进行了电流钳和电压钳全细胞记录,同时向突触前神经元内部溶液中加入了荧光黄,向突触后神经元内部溶液中加入Alexa594和神经生物素,用来帮助后续的AT定位细胞。电生理信号记录完后,脑片用AT技术检测各种突触相关蛋白的表达情况。这一方法将突触内在的结构和分子特征与生理功能联系起来,研究最小的突触连接,使得研究者可以更加深入地探究单个突触的功能,解决了长期以来困扰科研工作者的关于突触生理特征和可塑性与其解剖结构关系的技术难题。随着超高分辨率显微镜技术的不断发展,AT技[10]术也得到了进一步的发展。Markert等(2016)将传统AT中使用的荧光显微镜替换为超高分辨率显微镜,发展出了srAT(super-resolutionarraytomography)技术,使得AT技术可以应用于非常高的放大倍数。实验中,研究人员以线虫为研究样本,使用高压冷冻和冷冻替代技术对线虫组织进行了固定和脱水(相较于传统AT的化学固定和脱水,此方法可以最大限度的保持细胞原始状态),进而按照与传统AT相同的操作完成对组织的免疫标记和超高分辨率显微镜采集图像,最后完成电镜扫描和光镜/电镜图像拟合、分析。

实验中将AT与两种不同的超高分辨率显微镜技术——结构化照明显微技术(structuredilluminationmicroscopy,SIM)和随机光子重建显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)相结合,其中SIM侧向分辨率可以达到120nm,而STORM则可以达到20nm的侧向分辨率。使用SIM技术,实验结果清晰地显示出了神经细胞膜上以及内质网膜上带GFP标记的电突触结构-缝隙连接。使用STORM技术,实验结果可以明显地区分出单一的微[10]管结构。结论尽管诸如聚焦离子束扫描电镜(focused-[11][12]ionbeamSEM)、serial-blockfaceSEM等技术被[13-15]逐渐应用于生物组织精细三维结构的研究中,但是AT技术仍然具有其自身的优点,如:组织切片不会丢失,可以使用荧光显微镜反复采集图像;可以在同一样本上检测数十种抗原,在研究精细结构的同时还获得了多重免疫组织化学信息;可以研究包含数百万突触的大样本;可以灵活的和其他技术相[16]结合,阐释结构和功能的相关性。并且,随着各种自动化技术的应用,AT技术在通量上的劣势也必将会被弥补,AT也必将会在医学和生物学研究中发挥越来越大的作用。

作者:席超 靳溪 刘恺 刘进 庞婧 单位:北京师范大学生命科学学院 卫计委老年医学重点实验室

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