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高通量转录组测序技术在生物的应用

 论文栏目:生物技术论文     更新时间:2018/10/29 8:32:15   

摘要:要想研究基因结构和功能上的表现,则转录组研究是研究的主要部分,随着时代的发展,这些年来转录组测序技术已在动植物研究领域得到了广泛运用。高通量转录组测序技术在生物上的运用是本文研究和分析的主要基础,其主要研究领域包括未知基因挖掘、分子标记及相关代谢途径三个方面,参考近几年发表的有关转录组研究的文献,综述了转录组测序技术在各研究领域中的应用及取得的成果。

关键词:高通量;转录组;测序;生物

1研究背景

就转录组(Transcriptome)的定义而言,以特殊环境或特殊生理情况为依托,某个细胞、组织以及生物体里面所得RNA个数都被包含在内,包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)及其它的非编码RNA(non-codingRNA)。在生命活动中,不可缺少的就是蛋白质,mRNA是其主要编码形式,所以从狭义上来说,转录组其实是特指细胞能够通过转录实现的所有mRNA编码。就自然界而言,开放的体系环境为生物体的生长和发育提供了必要条件,由于生物与非生物的胁迫而造成影响,生物与非生物应激反应对动植物适应环境有重要作用,生物体只有通过自身应激反应适应环境才能存活[1]。一般而言,虫害以及病害,亦或是杂草都会影响生物的生长环境,导致生物逆境现象的出现。对植物而言,逆境会引起很多细胞内物质包括核酸、蛋白质、碳水化合物和氨基酸等的积累,这也进一步说明,对植物来说,在逆境胁迫的应答机制里面,除了传统的线性机制外,还会因为基因、信号途径以及由多基因产物和生物化学分子融合在一起而形成了相对复杂的反应机制[2]。就系统生物学和功能基因组时代而言,随着多个组学之间联合运用效果的实施,有助于生物学问题的全面解决。所以,就高通量测序技术来说,其和第二代测序技术之间存在极大相同点,所以有第二代测序技术的美名,除此之外,深度测序和高通量测序,也能表示其基本表现形态。因为这种测序技术,具有通量强、成本低廉等显著优势,所以备受研究者的重视,目前,高通量测序技术在缺乏基因组研究的各种动植物物种中扮演着不可或缺的主要角色,有一定的实践意义[3]。

2高通量测序技术的重要应用

2.1未知基因的挖掘

就一些未知基因组的物种而言,其研究结果的深入,离不开对已知相关基因的进一步研究。所以高通量测序技术能够促进对重要基因的进一步研究。从转录组给予的测序结果出发,对其基本情况进行下一步的深度分析。Zheng等[4]首先利用组织切片分析结合形态学分析选择杜鹃红山茶花芽发育的3个时期组织,通过对trinity软件的使用,使得测序数据的组装过程更加完善,最终研究出了213,316个转录本(长度≥200bp)。Kazuko[5-6]实验室对冷害、碱性、高盐,脱落酸(ABA)各种胁迫的水稻苗全基因组进行了转录组分析,通过cDNA微阵列和RNA杂交分析检测水稻应对各种胁迫表达谱,为将来研究植物如何应答非生物胁迫提供更有利支持。Zhang等[7]分别用条锈病CYR31、白粉病E09侵染冬小麦N9134,取不同时间小麦叶片,构建186,632Unigenes,其中N50为743bp通过基因水平和基因表达水平研究,发现感染条锈病和白粉病后,小麦差异基因富集抗病相关通路和表达情况之间具有显著的差异。使得小麦与真菌免疫互作相关的基因功能以及分子机制的进一步研究有了理论来源。WuB等[8]于2018用盐处理燕麦的根,选取不同时间段处理的根系,通过转录组测序得到了构建65,000Unigenes,并选取了24个上调基因进行荧光定量PCR检测,解析了燕麦耐盐响应的调控机理,转录组是特定基因获取的主要来源,随着研究的多样深化,最终发现测序数据在研究过程中其准确性和可靠性都大大增强,所以,其进一步推动了分子育种的发展进程,促进了表达分析的深入进行。

2.2相关代谢途径

基于转录组和代谢组联合分析,可以从大量转录组信息中发掘差异基因,快速判断核心调控网络和关键候选基因,促进转录因子功能的进一步分析明确,为生物体响应胁迫应答机制的进一步发展做阐述说明。Wang等[9]将萝卜的代谢途径以及萝卜根茎形成期中营养和风味之间的联系做了显著研究,促进了相关生物合成代谢分子机制的全方位确立,通过对转录组测序的运用,促进了55.73Mb长的显著数据库的形成。Li等[10]通过对转录组测序的运用,进一步促进了对河蟹的观察研究,对其代谢途径里面相关基因具体的表达分析做了显著说明,通过对荧光定量PCR的运用,促使15个差异表达基因的进一步鉴定与确定。Wang等[11]利用转录组测序在燕麦中研究了在磷缺乏和磷富足时根的转录和代谢响应。最终发现,有9371个至少两倍差异表达的转录本被实时鉴定到,在这上面,包括48个上调表达转录本,其被发现和有机阴离子在生物合成以及外流方面的表现之间关系密切,除此之外,有24个上调表达转录本能够在缺少磷的基础上,促进水稻和小麦之间表达趋势的完全统一性的建立。QianLou等[12]以蓝色花和白色花风信子为研究对象,通过转录组测序及代谢分析,揭示风信子花色变化机制。将过滤后的测序数据进行Trinity拼接获得89,926条Unigenes,其中N50为633bp。对Unigenes进行功能注释,其中143个与色素沉积相关,选取与花青素合成相关的2条通路,结合基因表达和代谢组分析,解析造成花色不同的机制。

2.3分子标记

一直以来,SSR标记都是以优良的分子标记而存在的,所以其在遗传进化的分析上运用甚广,基因功能在多态性的表现上扮演着重要角色,除此之外,在相近植物间之间通用性较强。对SNP来说,由于其具有较强以及较为广泛的覆盖率,所以在生物样本和定位基因的分析中运用甚广,属于热门标记里面不可缺少的一种。由于转录组测序在开发过程中促进了大量SSR标记以及SNP标记的出现,所以为遗传进化分析及功能基因挖掘的进一步完善奠定了基础。Graham等[13]将高度杂合及基因型差异显著的青蒿品种C4与C1作为研究的主要样本,促进了对F1群体的深入研究。将青蒿(Artemisiaannua)F1群体所具有的个体转录组作为测序分析的主要组体,最终发现有大量SNPs(1SNP/104bp)存在其中。Liu等[14]将麻竹等组织机构不同的材料(种子、花、叶、茎、嫩枝、根)作为分析对象,随着RNA被提取以后,促进其等量混合的进行,通过转录组测序的进一步实施,使得2.2G数据量缓慢形成,为该物种Unigene库的构建创造条件,促进103,354条转录本的全面组装,而且随着分子标记开发的进行,研究出了621个EST-SSR,使得后续研究有了一定的基础来源。Han等[15]将山苍子不同组织及果实不同发育时期作为主要研究材料,促进了转录组测序的进一步进行,使得68,648条Unigenes得以全面组装完成,N50表示的是838bp;研究出了2,674个SSR标记,而且从Unigene的实际情况出发,对其功能注释进行了全面分类。除此之外,橄榄树[16]、草植物龙须草[17]、辣椒[18]、鱼腥草[19]、苜蓿[20]、洋葱[21]等物种都促进了高通量测序的进行,也促进了SSRs或SNPs分子标记的大量出现和整体研究的进行。

3结论

和传统的芯片杂交平台不同的是,在转录组测序中,很少将已知序列的设计探针作为主要研究对象,所以无论是有参考基因组物种还是无参考基因组物种,都能在这个过程中得到研究,也就是说,它可以促进不同物种整体转录活动检测的进行,使其检测范围得到了显著提升和发展。转录组测序促进了数字化信号的传播,增强了其准确性和灵敏度上的优势。当测序深度不断增加,就能够促进低丰度表达转录本信息的进一步检测。随着检测通量的显著上升,使得项目周期大大降低,所以,就目前而言,转录组高通量测序在转录组的深入研究中扮演着重要角色。这些年来,随着时代的发展,高通量测序技术能在不同领域进行广泛应用,随着转录组测序技术的进一步开展,使其在新物种发现和新基因挖掘中作用显现,除此之外,也为分子标记以及代谢调控的深入研究奠定了理论基础,尤其是对那些资源信息薄弱的物种而言,其具有的应用价值显著增强[20]。随着现代生物技术的不断发展,就目前来说,要想从传统研究方法出发,促进对新型未知信息的开发研究,无疑于夸父追日,难上加难,而且其研究进程异常缓慢,然而转录组测序从自身优势入手[21],促进了大量未知序列及基因的研究开发,所以,其能根据不同的研究对象,对其难关相关序列基因进行找寻,使得基因表达、转录调控研究、基因诊断和治疗、基因检测、基因表达谱分析等方面的研究都有了一个可以参考的理论基础,尤其是对于那些未知基因组的物种来说,通过对转录组测序技术的运用,能够帮助他们获得一个新型的研究天地[22]。

作者:孙墨可 孙晓文 田娟 董玉迪 郭来春 王春龙 张曼 单位:白城市农业科学院 镇赉县芦苇湿地管理站

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