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MRD检测在急性白血病的研究进展

 论文栏目:白血病论文     更新时间:2017/8/9 10:51:34   

摘要:急性白血病是造血细胞自我更新能力增强、凋亡障碍以及细胞分化发育障碍所导致的造血系统恶性肿瘤,大多数白血病发病机制与细胞分子遗传学异常有关。MRD是指白血病诱导化疗完全缓解后体内残存109以下的白血病细胞的状态,为临床复发主要根源。流式细胞术和分子技术可检测异常免疫表型细胞、染色体异常、融合基因等表示MRD存在,是目前检测MRD的主要手段。

关键词:急性白血病;MRD;PCR

急性白血病在我国儿童及青少年中是一种常见恶性肿瘤。患者诊断时,体内有10101012数量的肿瘤细胞,经诱导缓解治疗,约60%90%患者达到完全缓解,完全缓解的患者体内仍存有106108数量的肿瘤细胞,称微小残留病(MinimalResidualDisease,MRD)[1],是急性白血病患者复发的根源,完全缓解后仍需强化巩固治疗,并检测MRD水平。MRD检测是急性白血病疗效判断的主要手段,医生根据MRD水平决定患者的化疗次数和强度,以及是否需要接受骨髓移植等其他治疗方式。近几年有研究表明,随着免疫学和分子生物学技术迅猛发展和检测技术特异性及灵敏度越来越高,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-timereversetranscription-polymer-asechainreaction,RT-PCR)可检测白血病目标靶基因表达,流式细胞术依据白血病免疫表型计算MRD%监测患者肿瘤负荷情况,有助于疾病预后的判断和个体化治疗[2-4]。故监测MRD水平是评估白血病治疗反应、尽力消除MRD、延长CR期及提高患者长期存活率的关键。本文就MRD检测在急性白血病中的研究进展作如下综述。

1急性白血病的MRD检测

1.1MRD的临床意义急性白血病主要的临床治疗手段包括联合化学治疗和造血干细胞移植(Hem-atopoieticstemcelltransplantation,HSCT),同时注重个体身体差异及治疗反应进行个体化治疗。早期联合化疗后60%90%患者可达完全缓解(completere-mission,CR),即患者骨髓中幼稚细胞﹤5%,外周血细胞基本达到正常水平,体内白血病细胞由1012降至109,骨髓形态学方法难以检出白血病细胞,呈血液学缓解状态,若不进行缓解后治疗如强化巩固治疗或造血干细胞移植等,短时间内易复发。故运用特异性、灵敏度高等检测方法在细胞生物分子水平上来监测MRD,根据MRD水平高低变化,对存有高度复发风险的急性白血病患者增加联合化疗的强度,另一方面减少复发风险低的患者由于过度化疗引起的毒副作用,同时尽量避免骨髓形态学缓解后仅凭借医师的临床经验或者盲目地治疗,及时选择最佳的联合化疗药物方案和进行SCT的最佳时间点,预测临床复发甚至达到最佳治愈的目标。1.2MRD检测方法及临床研究MRD检测方法包括细胞培养、形态学、Southern杂交、PCR技术、免疫表型和荧光原位杂交(Fluorescentinsituhybrid-ization,FISH)等。有些方法由于技术自身的特异性、灵敏度和临床操作性的原因,临床应用价值不大。目前检测MRD的技术主要有RT-PCR方法、流式细胞术(Flowcytometry,FCM)。1.2.1RT-PCR方法RT-PCR的引进使用超过近10年,是对急性白血病各亚型含有的染色体异位形成的融合基因、突变基因和异常表达的基因进行精确定量检测,以评估MRD水平,其显著特点是灵敏度可达10-610-5[5],使白血病细胞检测远超于细胞形态学检测阈值,目前已成为临床实验室检测MRD的首选[6],MRD监测基于特定的标记可以帮助我们预测白血病的复发并决定最佳的个体化治疗方案,主要分子标志有免疫球蛋白(Ig)的抗原受体重组、T细胞受体(TCR)、基因病变、融合基因等。在急性白血病中,结合RT-PCR方法,定时检测特异分子标志在AL患者体内表达的变化,可及时了解疾病的进展情况。PML-RARα是AML-M3型患者的一个特征性融合基因,黎承平等[7]运用RT-PCR技术对APL患者PML-RARα融合基因变化进行检测,随访18例的CR患者中2例出现分子学复发(PML-RARα再次阳性),提示临床预后不佳。刘龙等[8]采用该方法检测了APL患者初诊和CR阶段的PML-RARα融合基因表达,显示达CR时基因表达水平明显下降,但仍有较高的阳性率,经巩固化疗后其阳性率有所降低。在AML-M2型患者,约20%常见AML1-ETO融合基因的阳性表达,有实验者[9]检测该分子的表达以监测MRD水平变化,当患者在CR阶段,AML1-ETO转录值降低2个以上,其无病生存率更高,并且AML1-ETO的拷贝数越低,临床复发的可能性越低,相反,AML1-ETO转录增高,复发风险增加。张熔等[10]对儿童AML进行WT1、AML1-ETO基因检测,显示两者表达水平呈正相关关系,并且在预测AML复发方面,AML1-ETO具有更高的敏感性、特异度及准确度,认为更适合监测融合基因阳性的AML的MRD水平。在B细胞ALL儿童中,AML1-TEL融合基因阳性率约占20%~30%,Nakao等[11]运用RT-PCR方法检测该融合基因的表达量,结果可用于量化MRD的水平。薛芳等[12]对初诊ALL使用细胞遗传学、FCM和RT-PCR检测MRD水平,显示缓解期患者骨髓Ph染色体为阴性,RT-PCR检测BCR-ABL融合基因MRD阳性率高于FCM,认为Ph染色体核型分析技术不够灵敏,而RT-PCR检测MRD较FCM灵敏度更高,BCR-ABL基因阳性提示患者缓解率低,提示有不良的预后,治疗效果较差,达到缓解后也容易出现临床复发。对于缺乏的特征性分子标记的AL,也可采用RT-PCR方法监测MRD水平。最近十年研究显示,70%80%的白血病患者过度表达WT1基因,被认为是普遍白血病生物标记[13]。刘华胜等[14]对白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤患者进行WT1检测,结果白血病组WT1表达量明显高于非白血病组。顾伟英等[15-16]检测了患者异基因骨髓移植前后WT1表达,发现初诊及复发时WT1明显高于缓解后及对照组,且WT1再次上升时可提前40~180d预测白血病复发。故采用RT-PCR技术检测可为初诊患者检测出部分特异性分子或非特异性分子的表达,协助临床急性白血病的分型诊断以及根据基因的表达量判断初诊时患者的肿瘤负荷;通过实时定量检测AL患者治疗前后相关生物分子标记的表达变化,直观反应治疗过程中的MRD水平,有助于让临床医师判断疾病的预后情况,以便能够尽早的进行干预治疗避免血液学复发,提高患者的生存率。1.2.2FCM技术FCM技术依靠白血病细胞异常的免疫表型,即异常抗原表达(包括表达跨系列或交叉系列抗原、跨期或不同期的抗原共表达、抗原表达量的异常等)检测白血病细胞的比例,计算MRD%,灵敏度达10-510-4。已有研究表明,联合RT-PCR测AML患者CR后WT1基因表达和FCM计算MRD%,结果CR后MRD和WT1低水平患者复发率更低,并且WT1基因量与MRD值呈正相关关系[17],提高了检测MRD值的特异性及敏感度。近期有报道表明FCM技术和WT1基因表达两者结合,提高了急性髓细胞白血病预后移植前MRD的预后价值[18]。常莉等[19]采用FCM监测MRD,结果Cox分析显示第15天骨髓象未达M1状态、强的松试验不敏感、缓解后MRD≥0.01%是B-ALL复发的危险因素。也有学者将ALL治疗后第12周时MRD值≥10-3提示预后不佳作为预后指标判断更为可靠[20]。有实验室发现FCM检测急性白血病CR后患者MRD的值差异较大(10-610-2)[21],因此不能将MRD值作为临床评价CR的单一指标,应结合其他有效评估指标综合判断,提高MRD检测的阳性率,为个体化治疗及分层治疗提供指导作用。1.2.3FISH技术FISH方法是使用荧光素来标记染色体特异性探针和靶基因的DNA探针,通过染色体DNA原位杂交从而识别患者染色体结构和数量上的异常。该方法可准确定位染色体异常,并且能量化,但灵敏度只有10-310-2,实际临床的运用受到限制,故将FISH作为临床检测MRD的一个辅助方式。目前有学者将FISH和FCM技术相结合检测急性早幼粒细胞白血病中PML-RARα染色体异位,提高检测效益,并且与RT-PCR检测结果具有一致性[22]。

2展望

目前RT-PCR和FCM是检测MRD的比较公认的两种方法。虽然RT-PCR技术是目前检测MRD灵敏度最高的方法,但仅对拥有特异性分子标志的急性白血病,而对于大部分白血病初次发病时无特征的生物学分子标记的患者,此检测技术受到一定程度的限制,这一类患者临床表现及发病机理异质性较明显,临床预后方面也有差别。结合患者体内作为泛白血病分子的WT1定量检测,可以在一定程度上辅助判断患者体内白血病细胞的负荷,但是在急性白血病各亚型中WT1的表达情况各家研究报道不相符,原因是实验样本量的不足还是实验室技术的差别原因所引起,需多方面证实。WT1与白血病特异性的融合基因以及与FCM技术计算MRD%之间关系如何,如何结合两种方法来更加客观的评价患者MRD是我们需要进一步探究的问题。另一方面,FCM监测MRD的敏感性虽可以满足临床需求,各实验室多采用四色或八色抗体联合标记检测MRD%计算,但国内各实验室对于FCM检测具体操作的规范化、阳性阈值的选定、抗体之间组合的标准以及确定最佳MRD检测时间点等方面都未达成统一,检测的MRD值有较大差异,不能单独依靠FCM技术来评估疗效,须结合其他融合基因或异常基因多个检测指标综合判断。所以需要研究出如何更好的整合现有技术和资源,使急性白血病MRD的检测更加全面、更经济。

作者:俞钟 李海亮 单位:赣南医学院 2014级硕士研究生 第一附属医院血液

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