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成人和儿童急性白血病常见问题分析

 论文栏目:白血病论文     更新时间:2017/8/9 10:45:08   

【摘要】目的比较成人和儿童急性白血病常见融合基因表达的差异。方法采用多重巢式PCR技术检测159例成人和120例儿童初治急性白血病患者的常见融合基因,比较成人及儿童各融合基因的阳性率。结果儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者白血病融合基因总阳性率为51.11%(46/90),高于成人ALL患者的25.53%(24/94)(P<0.05);其中儿童TEL/AML1及TLS/ERG融合基因阳性率高于成人(P>0.05)。儿童急性髓系细胞白血病(AML)患者白血病融合基因总阳性率为53.33%(16/30),高于成人AML患者的26.15%(17/65)(P<0.05);其中儿童AML1/ETO融合基因阳性率高于成人(P>0.05)。结论成人及儿童急性白血病融合基因的表达存在一定差异,临床上应有针对性地进行相关融合基因的检测和判读,以提高诊疗质量。

【关键词】急性白血病;融合基因;巢式;聚合酶链反应

白血病是一种严重危害人类生命健康的疾病,发病人群多为儿童和青年。随着科学的发展,人们已认识到白血病融合基因是白血病的分子特异性标志,目前融合基因检测已广泛应用于白血病的分子生物学诊断、预后评估和微小残留病灶监控等领域。临床研究显示,成人白血病与儿童白血病在发病率、疗效、预后等方面均存在差异[1]。本研究通过检测成人和儿童急性白血病患者的融合基因,比较两者融合基因的阳性率,以期为临床急性白血病的诊疗提供参考。

1资料与方法

1.1临床资料

收集广西医科大学附属肿瘤医院2011年8月至2016年2月收治的279例初诊急性白血病患者,患者均经骨髓细胞形态学结合流式免疫分型确诊。其中成人患者159例,男105例,女54例,年龄17~80岁,急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)94例,急性髓系细胞白血病(acutemyeloidleukemia,AML)65例;儿童患者120例,其中男78例,女42例,年龄2~15岁,ALL90例,AML30例。两组性别构成与白血病分型比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2主要试剂和仪器

人淋巴细胞分离液(Solarbio公司,生产批号:20150514),TRIzol试剂(Invitrogen公司,生产批号:50175111),反转录试剂盒(Fermentas公司,生产批号:00304292),白血病常见融合基因筛查试剂盒(北京思尔成公司,生产批号:1604),热循环仪(Biometra公司,型号:TProfessionalPCR),干式恒温仪(杭州奥盛公司,型号:MK-20),凝胶成像系统(UVITEC公司,型号:FireReader),微量紫外分光光度仪(Thermo公司,型号:NanoDrop2000)。

1.3检测方法

1.3.1标本处理:严格按照无菌操作规程,取患者骨髓液2~3ml,乙二胺四乙酸抗凝,混匀。1.3.2多重巢式PCR检测:(1)细胞总RNA提取:分离出骨髓液中的单核细胞,采用TRIzol提取其总RNA,并通过微量紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度;(2)RT反应:Oligo(dT)18引物1μl、反转录缓冲液4μl、脱氧核糖核苷三磷酸2μl、RNA酶抑制剂1μl、莫洛尼式鼠白血病毒反转录酶1μl、RNA模板1μg,加水至20μl反应体系。42℃1h,70℃5min进行反转录反应合成cDNA;(3)PCR扩增:第1轮扩增条件:95℃5min,95℃30s,59℃1min,72℃1min,共25个循环,72℃8min;第2轮扩增条件:95℃5min;95℃30s,59℃1min,72℃1min,共29个循环,72℃8min;(4)电泳:取第2轮PCR产物,在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察并拍照。1.4统计学分析应用SPSS19.0软件进行统计学分析,计数资料比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

儿童ALL患者白血病融合基因总阳性率为51.11%(46/90),高于成人ALL患者的25.53%(24/94)(P<0.05);其中儿童TEL/AML1及TLS/ERG融合基因阳性率高于成人(P>0.05)。儿童AML患者白血病融合基因总阳性率为53.33%(16/30),高于成人AML患者的26.15%(17/65)(P<0.05);其中儿童AML1/ETO融合基因阳性率高于成人(P>0.05)。见表1。

3讨论

白血病是造血系统的恶性克隆性疾病,近年来,人们在对其发病机制的探索中已认识到在大部分白血病的发病中均存在染色体畸变,如缺失、重复、易位等,这可导致原癌基因激活或抑癌基因失活,从而产生编码融合蛋白的新融合基因,进而出现白血病表型。目前学界一致认为,与儿童白血病的高治愈率相比,成人白血病的长期无病生存率相当低,两者长期预后的巨大差别可能与患者的临床情况、治疗方案、白血病细胞的生物学特征等因素有关[1]。既往研究表明,约1/3的ALL患儿表达因染色体易位形成的融合基因[2]。本研究比较了成人和儿童急性白血病常见融合基因的表达情况,结果显示,ALL患儿融合基因总阳性率远高于成人患者(P<0.05)。此外,由于儿童AML发病率较低,关于其融合基因检测的相关报道并不多见。本研究结果显示,AML患儿融合基因检出率亦显著高于成人患者(P<0.05)。TEL/AML1融合基因可使AML1从转录激活因子转变成转录抑制因子,同时其表达生成的TEL/AML1融合蛋白还使AML1调节靶基因表达受抑,影响造血干细胞的自我更新和分化能力[3]。Vrooman等[4]研究结果显示,TEL/AML1是儿童ALL最常见的基因改变,其在儿童ALL中的阳性率为18%~25%,而在成人ALL中的阳性率很低(<2%)。TEL-AML1作为一项重要的预后指标,其阳性表达提示ALL属临床低危型,与化疗敏感、复发率低相关[5]。在本研究的儿童ALL样本中,TEL-AML1融合基因阳性患儿占18.89%,高于成人ALL中的阳性率(1.06%)(P<0.05),这与Vrooman等[4]的结果相似。BCR/ABL融合基因编码的BCR/ABL融合蛋白是改变控制造血干细胞增殖、自我更新信号系统的主要蛋白激酶,广西医学2017年7月第39卷第7期359它能激活酪氨酸激酶,与白血病发病相关[6]。BCR/ABL是成人ALL最常见的融合基因,约有10%~30%的成人ALL患者可见BCR/ABL融合基因,而在儿童ALL患者中发生率较低,约为2%~6%[7]。此外,既往研究报道BCR/ABL融合基因也在AML患者中被检出,此类患者诱导缓解率低,生存期短,治疗上尚无统一方案[8]。本研究结果显示,BCR/ABL基因的ALL患儿阳性率为13.33%,与成人ALL患者比较,差异无统计学意义,其表达率高于蔡文治等[7]的报道,可能与入组人群的选择偏倚和中心样本量偏少有关。值得注意的是,本研究检测到1例BCR/ABL融合基因阳性的成人AML患者,提示AML患者也可携带BCR/ABL融合基因。据报道,3%~6%的ALL儿童和5%的成人ALL患者染色体存在t(1;19)(q23;p13)易位导致的E2A/PBX1融合基因[1,3]。本研究结果显示,成人ALL患者E2A/PBX1融合基因阳性率为4.26%,低于儿童的8.89%,但两者比较,差异无统计学意义(P>0.05),与文献[3]研究结果相似。TLS/ERG是一种较少见的核型异常导致的融合基因,TLS/ERG阳性的急性白血病患者的病程进展较快,常规化疗难以完全缓解或完全缓解持续时间较短,且复发后很难再次缓解[9]。本研究中共有7例ALL患儿检出TLS/ERG融合基因,检出率高于ALL成人患者(P<0.05);此外,本研究检出2例TLS/ERG阳性AML患儿,也显示了TLS/ERG并非ALL患者所特有的融合基因。MLL基因重排阳性的急性白血病从出生至成人期均可发生,此类白血病大多恶性程度高,对常规化疗不敏感,缓解率低,MLL基因阳性可作为白血病预后不良的独立指标[10]。目前发现MLL基因易位重排类型有60多种,已鉴定的约30种,其常见的融合基因有MLL/AF4、MLL/AF9,MLL/ELL,MLL/AF6和MLL/AF10[11]。MLL基因易位重排在儿童ALL中发生率大约为6%,在儿童AML中发生率大约为14%[12]。本研究中ALL和AML患儿MLL基因易位重排的阳性率分别为2.22%、6.67%,低于文献[12]中的报道,考虑与本研究仅检测MLL/AF4、MLL/AF9和MLL/ELL3种常见的融合基因类型有关。此外,本研究结果显示,ALL和AML成人患者的MLL基因重排阳性率与儿童患者相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。PML-RARα融合基因由t(15;17)(q22;q21)染色体易位形成,见于绝大多数AML-M3患者,是急性早幼粒细胞白血病的特异性标志和全反式维甲酸治疗起反应的分子基础[13]。本研究中AML患儿PML-RARα融合基因阳性率高于成人患者,但两者相比,差异无统计学意义(P>0.05)。在伴有嗜酸性粒细胞增多的髓系白血病细胞中,染色体倒位inv16(p13q22)或易位t(16;16)(p13;q22),使得位于16p13的MYH11基因与位于16q22的CBFβ基因发生重组,进而形成CBFβ-MYH11融合基因,其在髓系白血病中检出率约为7%[14]。本研究结果显示成人AML患者CBFβ-MYH11融合基因的表达率为7.69%,与文献[14]中的报道相似,而在儿童患者未检测到阳性病例。AML1/ETO融合基因常见于急性粒细胞白血病M2型,一般认为是预后良好的标志之一,该类患者的临床完全缓解率高达90%,5年存活率达50%~70%[15]。本研究结果显示,AML患儿AML1/ETO融合基因的检出率为13.33%,显著高于成人AML患者的1.54%(P<0.05)。综上所述,无论是ALL还是AML,成人和儿童在融合基因表达方面存在一定差异,提示临床医师在面对不同类型和年龄的急性白血病患者时,应有针对性地进行相关融合基因的检测和判读,以提高诊疗质量。

作者:唐艳萍 蔡政民 唐亚梅 苏程琳 谭晓玉 谢雨萱 利基林 单位:广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部

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