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谈人卵巢癌细胞靶向多肽的筛选

 论文栏目:癌细胞论文     更新时间:2017/12/7 9:15:16   

摘要:采用改良的生物淘筛(Biopanning)流程,以人卵巢癌细胞为靶细胞进行5轮消减筛选,从噬菌体展示12肽文库(Ph.D-12phagedisplayedpeptidelibrary)筛选到靶向人卵巢癌的12肽克隆,通过ELISA、细胞免疫荧光法等方法从细胞水平鉴定了最佳阳性多肽噬菌体克隆R20靶向卵巢癌细胞的特异性和敏感性。结果显示:R20可以特异的、敏感的与卵巢癌细胞SKOV3结合,不与正常细胞或者其他癌细胞结合,具备进一步研发为卵巢癌导向分子元件而应用于卵巢癌靶向诊治试剂或药物研发的潜力。

关键词:卵巢癌;靶向肽;噬菌体肽库;分子影像学诊断;靶向治疗

卵巢癌发病率位于妇科肿瘤第三位[1],死亡率很高,早期难以发现,发展迅速,治愈率低[2-3]。但卵巢癌的诊治还缺乏理想的方法,许多病人由此丧失了治疗最佳时机[3]。癌症治疗包括手术、化疗、放疗和免疫疗法等,大多患者确诊时或手术后必须采用化疗治疗。然而,当前化疗药物大多靶向性不强,疗效欠佳而毒副作用很强。研发靶向诊治试剂药物是当务之急,而靶向分子元件是这种研发首先需要解决的问题,所以靶向多肽便被寄予了厚望。噬菌体展示多肽文库(Phagedisplayedpeptidelibrary)的淘筛(Biopanning)技术是目前筛选靶向多肽最为有效的技术。多肽具有分子量小、无毒、免疫原性低、易合成、高特异性等特点,被广泛应用于生物医学各个领域。癌靶向多肽作为靶向分子元件,不仅可用于癌症早期分子影像学诊断试剂研发,而且可用于研发与其他生物材料及抗癌药物等偶联形成的靶向化疗药物,这可以大大提高药物疗效并明显降低其毒副作用,对于卵巢癌或其他癌症临床具有极其重要的意义。本文依上述技术筛选获得38个阳性克隆,测序获得9条共有序列;且确定R20为最佳阳性克隆,其对未来卵巢癌的靶向诊治及癌防治面临的问题具有重要意义。

1材料与方法

1.1主要实验材料

Ph.D-12肽库:购自美国NEB(NewEnglandBiolabs,Boston,MT)。SKOV3(人卵巢癌细胞)和HEK293(人胚胎肾星形细胞)细胞系:购自美国ATCC(AmericanTissueTypeCollectionCenter,Rockville,MD)。以DMEM/RPMI1640完全培养基加青/链霉素和庆大霉素溶液在5%CO2恒温培养箱(SheldonManufacturingInc,LosAngeles,CA)、37℃培养。DMEM培养基、胰蛋白酶:Gibco公司(NewYork,NY)。PEG8000:索莱宝科技有限公司(北京)。IPTG、X-gal、BSA:西安沃尔森生物技术有限公司。抗体:(1)山羊抗M13多克隆抗体购自SantaCruzBiotechnologyInc(美国);(2)辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗山羊多克隆抗体,北京博奥森生物技术有限公司。四甲基联苯胺(TMB)、DAPI细胞核染液:西安沃尔森生物技术有限公司。

1.2主要实验方法

1.2.1改良的十二肽库Biopanning在NEB(NewEnglandBiolabs)试剂盒Ph.D-12说明书提供的实验步骤基础上,做了以下改进:每克隆噬菌体摇菌液由烧瓶内25mL改为试管内3mL;每轮Biopanning前加一步非癌细胞的吸附步骤。其余步骤同说明书。以SKOV3细胞为靶细胞,以HEK293细胞为消减筛选阴性吸附细胞,进行5轮消减筛选。随机挑取60个噬菌体克隆,以ELISA筛选阳性噬菌体克隆。1.2.2ELISA常规96孔板法,使用ELX800全自动酶联免疫检测仪(BIO-TEK,LosAngeles,CA)。阳性标准为实验孔A450为对照孔光密度A450的2.1倍(重复3次)。1.2.3噬菌体克隆测序由专业公司进行。获得各克隆十二肽序,分析得到共有序列(consensusse-quences)。1.2.4细胞免疫荧光法以SKOV3细胞、正常细胞、其他癌细胞鉴定最佳阳性克隆及其靶向特异性和敏感性。具体做法简述如下:取高压灭菌的8mm×8mm盖玻片置30mm培养皿中,取生长状态良好的细胞进行传代并计数,每皿加1×105cells/mL细胞悬液,并加2mL完全培养基,5%CO2、37℃培养。待细胞融合率80%时吸弃培养基,用1.5mLPBS洗涤盖玻片3次后以1mL4%多聚甲醛溶液固定,用PBS洗涤3次后于培养皿加入1mL1%BSA在37℃封闭30min。滴加20μL阳性噬菌体克隆提取液(1×1011pfu/mL),37℃孵育2h。滴加20μL山羊抗M13多克隆抗体(1∶200稀释于PBS)4℃过夜,用1mLPBS洗涤3次。滴加20μLFITC标记兔抗山羊IgG(1∶100避光稀释于PBS),37℃孵育2h。PBS洗涤3次后滴加20μLDAPI细胞核染液(1∶500稀释于PBS),37℃15min。PBS洗涤3次后滴加少许甘油进行封片后于倒置荧光显微镜成像。

2结果

2.1以改良生物淘筛(Biopanning)进行的消减筛选结果

每轮生物淘筛先以HEK293细胞对肽库共孵育以达到负筛选的目的,再将HEK293细胞吸附过的肽库与SKOV3细胞孵育。经过5轮“吸附→洗脱→富集”筛选,得到五级噬菌体克隆。每一轮噬菌体投入量为1.5×1011pfu,滴定结果(表1,图1)显示回收率逐步提高,表明靶向卵巢癌细胞的噬菌体得到了明显富集。

2.2以ELISA进行的阳性噬菌体克隆鉴定结果

从第5轮生物淘筛后的洗脱液铺板于上铺含四环素(使用方法见肽库说明书)和X-gal(使用方法见肽库说明书)的0.75%琼脂糖、底层为1.5%琼脂的90mm平皿,37℃过夜培养后随机挑取60个克隆(蓝色噬斑),进行扩增(3mL/克隆),然后进行ELISA检测。结果如图2。共获得48个阳性克隆,对它们及对照克隆(阴性和无关克隆)提取M13噬菌体单链DNA测序,测序正确的阳性克隆38个,通过对相应多肽序列的分析得到9条共有序列,如表2所示。

2.3以细胞免疫荧光法进行的最佳阳性噬菌体克隆鉴定结果

上述9条共有序列各随意选取一个克隆作为本序列唯一代表克隆,其余克隆丢弃。使用细胞免疫荧光法对9个共有序列代表克隆(R5,R6,R10,R12,R18,R20,R33,R46和R47)的特异性和敏感性进行进一步的鉴定,以鉴定最佳阳性代表克隆。2.3.1从共有序列对靶细胞结合的特异性与敏感性比较筛选最佳克隆将9个代表克隆分别与SK-OV3细胞和HEK293细胞进行细胞免疫荧光检测,结果表明所有代表克隆与SKOV3细胞均有特异性结合亲和力,但R20(即OSP2序列)最佳(图3)。但同样处理情况下,9个代表克隆、URP和PBS对照与SKOV3细胞、HEK293细胞均无亲和力。据此,R20克隆被确定为最佳阳性克隆。2.3.2最佳克隆R20(即OSP2序列)与靶细胞结合的特异性与敏感性鉴定通过细胞免疫荧光,检测R20克隆与其他本实验室保存的肿瘤细胞SGC7901(胃癌细胞)、SMMC-7721(肝癌细胞)、Si-Ha(宫颈癌细胞)、MCF7(乳腺癌细胞)和Caco2(结直肠癌细胞)的结合特异性。结果(图4)表明,R20只与SKOV3发生特异性结合,进一步证明R20肽序列能够很好地靶向卵巢癌细胞。

3讨论

癌症靶向诊治是目前癌症临床的关键瓶颈问题,而这一问题解决的关键就是如何把试剂、药物极其靶向性地输送到肿瘤组织。目前,绝大多数药物、试剂恰恰就是缺乏这一靶向性而导致其临床效果不佳而毒性突出[4-6]。癌细胞表面可以表达其独特的抗原或表位而作为诊治的靶标,而利用肽库筛选技术可以获得针对这些靶标结合的特异性多肽[7-8]。目前,已经报道了某些肿瘤特异性的多肽,如针对小细胞型肺癌(NSCLC))的多肽SP5-2等[9],但是还没有针对卵巢癌的靶向多肽。本课题采用噬菌体展示肽库的改良Biopanning技术,通过亲和消减筛选,从60个随机挑选的克隆获得了38个阳性克隆,测序获得了9条共有序列。通过对9个共有序列以细胞免疫荧光实验检测,发现克隆R20靶向卵巢癌细胞SKOV3的特异性和敏感性最佳,确定R20(即OSP2序列)为最佳阳性克隆(序列)。根据最佳共有序列合成多肽在未来的卵巢癌靶向诊治特别是靶向化疗药物递送系统研发方面意义重大[10-14]。合成肽可以被荧光素、同位素等标记而成为卵巢癌特异性探针,然后直接用于卵巢癌的早期分子影像诊断。合成肽更有意义的用途是与当前化疗药物、纳米药物材料、热疗或光疗材料等偶联形成卵巢癌靶向性药物或试剂,从而给予抗癌药物很好的靶向性,使药物的癌细胞杀伤效果明显提高的同时大大降低其毒副作用,这对于克服目前癌症防治面临的问题具有巨大临床价值。如图5所示,可以以R20多肽偶联内含化疗药物、特定功能的核酸分子或某特定功能基因的表达质粒,形成卵巢癌靶向的化疗药物载体系统。R20克隆还有待于未来进一步验证其卵巢癌靶向特异性和敏感性,而这些研究的首要步骤是根据OSP2序列合成多肽。这种合成的12肽需进一步在细胞、临床组织样本、癌组织芯片[15]、卵巢癌动物模型体内验证其卵巢癌靶向特异性和敏感性。

4结论

本文从Ph.D-12肽库以改良Biopanning技术筛选获得38个阳性克隆,测序获得9条共有序列。通过细胞水平的特异性和敏感性检测,确定克隆R20,即共有序列OSP2靶向卵巢癌细胞SKOV3的特异性和敏感性最佳,确定R20为最佳阳性克隆。克隆R20,即共有序列OSP2可用于未来的卵巢癌靶向诊治特别是靶向化疗药物递送系统研发,对于克服目前癌症防治面临的问题有着重大意义。R20克隆还有待于未来以合成肽形式进一步在细胞、临床组织样本、癌组织芯片、动物模型中验证其卵巢癌靶向特异性和敏感性。

作者:侯依凡 刘政 薛昌志 宋喜贵 侯颖春 单位:陕西师范大学 生命科学学院

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