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热带假丝酵母唑类耐药相关基因分析

 论文栏目:热带农作物论文     更新时间:2018/1/9 10:40:43   

假丝酵母(又称念珠菌)属引起的真菌感染在世界范围内显著增多,非白念珠菌(non-albicansCandida,NACA)的分离率也逐年上升[1]。几十年来,热带念珠菌在不同地域的癌症、中性粒细胞减少症、恶性肿瘤和长期药物治疗患者中已成为排名一二的NACA[2]。研究发现,耐唑类药物热带念珠菌的分离率呈上升趋势[3-4]。中国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)数据显示[4],近5年(2009年8月—2014年7月)氟康唑的耐药率从11.2%增至42.7%,伏立康唑的耐药率从10.4%增至39.1%;2013—2014年耐唑类药物热带念珠菌的分离率呈迅速上升趋势,且分离率上升与临床药物使用量无关。全球SENTRY监测报告显示[5],来自31个国家(2013年)的热带念珠菌中,氟康唑耐药率为11.6%,其中81.8%来自亚太地区,31.8%来自中国。

1靶基因ERG11过度表达和突变

1.1唑类药物的作用靶酶

14-α去甲基化酶(14α-demethylase,14-DM)是麦角固醇合成的关键酶,由ERG11基因编码合成[6]。麦角固醇是维持细胞膜正常的结构,是念珠菌细胞膜的主要固醇,可影响多种膜结合酶的功能。固醇合成阶段包括形成角鲨烯、角鲨烯转化为羊毛甾醇后生成麦角固醇,其中麦角固醇的形成是真菌合成固醇的特有阶段[7]。唑类药物与14-DM结合,阻止酶底物与14-DM结合,影响羊毛甾醇14α-甲基的羟基化反应,从而抑制真菌细胞膜中麦角固醇的生物合成,发挥抗真菌作用。

1.2ERG11过度表达

ERG11过度表达增加了细胞中靶酶的量,需更高效力的唑类药物与靶酶结合才能达到抑菌效果[6]。研究证实,耐氟康唑热带念珠菌中ERG11过度表达[8-11]。Jiang等[8]研究中国52株来自临床的热带念珠菌发现,耐唑类药物热带念珠菌中ERG11平均表达水平高于敏感菌4倍以上,麦角甾醇含量增加,对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐药的分离株中ERG11表达水平比单独耐氟康唑或伊曲康唑的分离株更高。

1.3ERG11突变

ERG11突变可引起其编码的酶的活性和三维结构发生改变,降低其对唑类药物的亲和力,使药物不能有效发挥作用[6]。临床研究发现,热带念珠菌中越来越多的ERG11突变与唑类耐药相关。耐唑类药物热带念珠菌中,可能与耐药相关的氨基酸置换有D81A[12]、Y132F[8-9,12-13]、S154F[7-9,12]、R245K[10]、Y221F[10]、V362I[10]、K143Q[9]、K143R[14]等。部分研究[8-9,12]发现Y132F和S154F在耐药株中同时出现,有实验[8]证实ERG11突变导致的Y132F和S154F置换降低了酿酒酵母对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑(尤其是对氟康唑和伊曲康唑)的敏感性。有研究发现[14-15]K143Q、K143R置换位于ERG11的唑类结合活性位点附近。根据建立的蛋白质同源性模型和Chau等[16]的研究,认为K143Q、K143R置换可能引起热带念珠菌对唑类药物耐药。由于14-DM的活性位点在血红素远端,深埋于蛋白内部,唑类药物需通过较长的通道才能到达[17]。三维分子建模软件分析表明,D81A、Y132F和S154F分别位于唑类药物进出通道的上方、通道内和通道开口,可能影响唑类药物进入通道,导致14-DM与氟康唑的亲和力下降而产生耐药[12]。在耐唑类药物热带念珠菌中发现的氨基酸置换,还需进一步的实验证实和全面的流行病学研究以确定具体机制。在氟康唑剂量依赖株和氟康唑耐药株的ERG11中也会出现某些沉默突变,虽不改变氨基酸序列,但可能影响蛋白与药物相互作用位点的结构[18]。因此,热带念珠菌ERG11基因的沉默突变可能与耐药有关,还须进一步研究证实。

2upc2基因过度表达和突变

2.1锌族转录因子

Upc2pupc2基因编码锌族转录因子Upc2p,这是一种具有调控基因表达功能的蛋白,为真菌所特有。已证明,ERG11的上调和突变是热带念珠菌耐唑类药物的主要机制之一[8]。Upc2p具有转录调节功能,可调控ERG11表达,有必要对其进一步研究。目前,对热带念珠菌upc2的研究较少,但越来越受重视。

2.2upc2基因过度表达和突变

Jiang等研究upc2的表达和序列改变,结果显示31株耐唑类药物热带念珠菌中upc2显著过度表达[19],对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐药的分离株中upc2表达水平比单独氟康唑或伊曲康唑耐药株更高。upc2启动子区域含有T118G和G155A突变,两种突变可同时存在(在多重耐药分离株中始终同时存在)。他们还检测到G392E置换,并以酿酒酵母为表达宿主,证明G392E置换可显著降低酿酒酵母对氟康唑和伊曲康唑的敏感性。Choi等[11]对热带念珠菌upc2进行测序,发现突变基因导致的氨基酸置换,但这些突变出现在未过表达ERG11的氟康唑敏感菌株中,因此进一步研究upc2基因的改变对调控ERG11功能的影响很有必要。upc2过度表达和突变对ERG11的影响而导致的耐药还需更多研究证实,未来可深入研究upc2启动子T118G和G155A突变在热带念珠菌Upc2p转录调控ERG11中的具体作用。

3外排泵基因cdr1和mdr1过表达

3.1外排泵ABCT和MFS

目前认为,真菌细胞中与唑类耐药相关的外排泵主要有两类:一类是ATP结合盒转运蛋白家族(ATPbindingcassettetransporter,ABCT),为一种能量依赖型外排泵,通过水解ATP获得能量,以主动转运的方式增加药物外排,从而降低细胞内药物浓度而产生耐药;另一类是主要易化扩散载体超家族(majorfacilitatorsuperfamily,MFS),为非能量依赖型载体,主要依靠跨膜质子浓度差,以被动运输的方式向细胞外泵出药物,降低细胞内药物浓度而产生耐药[20]。可能与热带念珠菌唑类耐药相关的外排泵有:cdr1基因编码的Cdr1p是对唑类药物产生耐药的最主要ABCT,mdr1编码的Mdr1p是近年来关于唑类耐药研究最多的MFS[20]。

3.2外排泵基因cdr1和mdr1过表达

谢宏等[20]针对药物外排泵基因,对临床分离的热带念珠菌氟康唑敏感株和耐药株中的cdr1和mdr1表达进行研究,结果显示两种外排泵基因在敏感株和耐药株中均有表达,且耐药株中的表达高于敏感株,与文献[10,21]报道一致。Choi等[11]分析热带念珠菌发现,mdr1和cdr1表达在氟康唑低敏感株(最低抑菌浓度1~2μg/mL)和氟康唑不敏感株(最低抑菌浓度4~64μg/mL)中均明显高于对照组(最低抑菌浓度0.125~0.5μg/mL)。有学者在耐唑类药物热带念珠菌中也观察到ABCT上调[14],认为外排泵基因的过度表达可能与热带念珠菌耐唑类药物相关。有研究显示,氟康唑耐药株mdr1过表达率显著高于敏感株,而耐药株cdr1过表达率与敏感株无显著统计学差异,表明热带念珠菌临床分离株的耐药与MFS高表达相关[9]。Jiang等[8]研究mdr1和cdr1表达时发现,氟康唑敏感株与耐药株之间无显著差异,与Vandeputte等[22]的研究结果一致。因此有学者认为,与ERG11相比,外排泵基因似乎在热带念珠菌耐唑类药物中不起关键作用。目前为止,直接描述这些外排泵基因潜在作用的实验尚未在热带念珠菌中进行,仍需进一步的实验证实和全面的流行病学研究。

4其他相关基因的过度表达

有研究发现[23],耐唑类药物热带念珠菌中,sod、oat、acoat、dapaat和abat这5种基因过度表达可能是唑类耐药的潜在新标记。5种基因编码的酶包括涉及抗氧化防御的超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、鸟氨酸氨基转移酶(ornithineaminotransferase,OAT)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(acetylornithineaminotransferase,ACOAT)、腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸氨基转移酶(diaminopelargonicacidaminotransferase,DAPAAT)和4-氨基丁酸氨基转移酶(4-aminobutyrateaminotransferase,ABAT)。后4种属于磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate,PLP)依赖酶,在许多真菌细胞周期中发挥重要生理作用。大多数抗真菌药物可通过在酵母细胞中产生高水平的胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)诱导细胞死亡。SOD可催化超氧自由基向过氧化氢和二氧化碳转化,在保护细胞免受超氧化物毒性方面发挥重要作用[24]。耐唑类药物热带念珠菌中sod过度表达,可能减少ROS诱导的细胞死亡,从而使热带念珠菌产生耐药。oat、acoat、dapaat和abat编码的酶属于PLP依赖性天冬氨酸氨基转移酶家族,在三羧酸循环前体生成中起主要作用,其过度表达导致真菌细胞产生大量ATP。念珠菌产生耐药的机制之一是真菌细胞膜上的ABCT通过ATP水解获得能量,从而有效将药物排出细胞外[25]。耐唑类药物热带念珠菌中oat、acoat、dapaat和abat过度表达,产生大量ATP,有助于ABCT将细胞内药物排除而产生耐药。综上所述,sod、oat、acoat、dapaat和abat过度表达可能与热带念珠菌耐唑类药物有关。

5结语

热带念珠菌的唑类耐药率升高给临床治疗带来了阻力,耐药性的形成与相关耐药基因的过度表达和突变有一定关联。但耐药机制有多种,相互之间作用复杂,仍需不断深入研究,从而为临床提供参考和理论依据。

作者:唐娜 郭大文 单位:哈尔滨医科大学附属第一医院检验科

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