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检测重金属离子生物传感器综述

 论文栏目:生物技术论文     更新时间:2013-11-27 11:14:55   

1生物传感器检测重金属离子

1.1酶生物传感器

酶生物传感器已经被广泛的应用于临床诊断和食品安全检测,其原理主要是应用酶的专一性生物催化作用,检测底物或生成物的浓度变化,如葡萄糖生物传感器[2]、Vc生物传感器[3]等。而酶生物传感器用于重金属检测则是利用重金属离子对酶产生的抑制作用影响酶的活性,使底物或产物产生浓度变化。抑制现象专一性的降低,使得对重金属的检测只能得到总的重金属量,而不能对产生影响的各种离子分别定量。研究人员对不同的酶传感器进行了研究。Guascito等[4]利用固定葡萄糖氧化酶生物传感器,通过安培法检测过氧化氢的分解状况,分别对Hg2+、Ag+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Cr3+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+及CrO42-对酶的抑制效果进行了测定,从而检测重金属离子。相类似的,Mohammadi等[5]利用固定化葡萄糖氧化酶和转化酶,通过恒电位法检测蔗糖的含量;同时利用Hg2+对转化酶的抑制作用影响了蔗糖的转化率,对Hg2+进行测定,检测限达到1×10-8-1×10-6mol/L。脲酶是一种分布广泛的酶,也是检测重金属离子常用的生物材料,它可以和不同形式的换能器相结合。Kuswandi[6]报道了一种简单的光纤生物传感器,利用重金属离子对脲酶的抑制作用进行监测,脲酶固定在一层超滤膜上。研究重金属离子Hg2+、Ag+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+和Pb2+的抑制作用,是通过生物催化活性下降时尿素水解量变少而引起pH变化,在615nm波长处由光纤生物传感器进行检测。脲酶的活性可以通过加入半胱氨酸得到再生。流动注射检测Hg2+使得线性范围是1×10-9-×10-5mol/L,检测限为1×10-9mol/L(0.2μg/L)。MayMay等[7]将脲酶通过自组装单层膜固定在SPR传感器的金镀膜玻璃电极表面,检测镉离子对酶的抑制效果,证明了SPR生物传感器可以用于重金属离子的检测。其他的酶类也能用于重金属离子的检测。Ogunseitan[8]利用氨基乙酰丙酸脱羧酶检测铅离子的生物可利用度。Berezhetskyy等[9]开发了一种碱性磷酸酯酶电容生物传感器来检测水中的重金属离子,该方法也利用了重金属离子对酶的抑制作用。结果表明,各种重金属离子对该酶的抑制效果顺序为Cd2+>Co2+>Zn2+>Ni2+>Pb2+,检测限分别为Cd2+0.5mg/L、Co2+和Zn2+2mg/L、Ni2+5mg/L、Pb2+40mg/L。黑曲霉硝酸还原酶的活性也受到各种重金属离子的抑制,因而也能用来检测重金属离子污染[10]。Michel等[11]利用细胞色素3的Cr6+还原酶活性,研制了一种新的安培生物传感器,能够直接、快速的检测Cr6+。研究人员对酶的高度专一性保持了持续热切的兴趣。2012年,Soldatkin等[12]开发出了一种三酶(转化酶、变旋光酶和葡萄糖氧化酶)复合体系生物传感器,以陶瓷薄膜电极为支撑基质、电容大小的改变为检测信号进行检测。该传感器对Hg2+、Ag+有较好的检测特异性。

1.2细胞生物传感器

不同的细胞被用作生物传感器的生物敏感元件来检测重金属离子,表现出了不同的性质。Alpat等[13]利用Tetraselmischuii海藻细胞作为生物传感器的组成部分,对Cu2+进行检测。固定在碳糊电极上的海藻通过被动吸附能够积累重量百分比范围2.5%-20%的Cu2+,然后通过伏安测量进行检测,检测限能达到4.6×10-10mol/L。Durrieu等[14]则利用微球藻Chlorellavulgaris细胞膜外部的碱性磷酸酯酶对重金属的敏感性制成了光学生物传感器,球藻细胞被固定在了一层可以移去的膜上,置于光纤的尖部。对镉和铅离子在浓度范围为0.01-1mg/L进行了检测,碱性磷酸酯酶由于处于自然环境中而提高了其活性和稳定性。研究重金属离子对动物细胞的损伤过程,对于人们了解重金属的危害从而采取一定的预防措施有重要意义,这也需要生物传感器发挥生物敏感层一般由酶、抗体、核酸和细胞等组成图1生物传感器基本原理示意图作用。Liu等[15]用心底细胞作为生物传感器的生物敏感元件来检测重金属离子的危害。Hg2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+等能引起心肌细胞在15min内表现出频率、振幅和持续时间的变化。Hiramatsu等[16]则利用基因工程小鼠作为传感器,研究了重金属对内质网的影响作用形式。生物传感器能够实现在体外近似模拟体内环境,从而使研究结果更具有实际意义。2.2.3微生物各种微生物的细胞也能被用来制作生物传感器,检测重金属离子。Tag等[17]利用酵母作为生物传感器的一部分,采用安培法流动注射分析Cu2+,该株酿酒酵母转入了融合了大肠杆菌lacZ基因代替了相同的包含Cu2+诱导启动子CUP1基因的质粒。这些菌株对不同的Cu2+浓度产生不同的灵敏性,两株不同的转基因酵母对于实际样本中Cu2+的检测浓度分别为1.6-6.4mg/L,0.05-0.35mg/L。Liao等[18]用绿色荧光蛋白细菌[EscherichiacoliDH5α(pVLCD1)]生物传感器对土壤中重金属的生物可利用度进行了检测。检测时间2h时Cd2+、Pb2+、Sb3+的检测浓度分别为:0.1nmol/L、10nmol/L和0.1nmol/L。Sumner等[19]则利用了从热带珊瑚中发现的野生红色荧光蛋白制成生物传感器并对Cu+、Cu2+进行检测。该仪器对于铜离子有较强的专一性,可以在一定程度上抵抗其他离子的干扰,红色荧光蛋白的检测限优于绿色荧光蛋白7个数量级。Amaro等[20]则以四膜虫(TetrahymenathermophilaMTT1、MTT5)金属硫蛋白激活子的真核生物荧光素蛋白基因作为信号载体,开发全细胞生物传感器,期间侧重金属离子的灵敏性可与原核生物相当。基因工程微生物在重金属离子检测方面也发挥了作用。科学家利用生物技术开发了两株具有特殊性能的细菌[21]:E.coliMC1061携带pmerRluxCDA-BE质粒(Hg-传感器)或携带parsluxCDABE质粒(As-传感器),并将其与光纤换能装置相结合构成生物传感器,对Hg、As进行检测,检测限可达到Hg2+、As5+和As3+分别为:μg/L、141μg/L和18μg/L。生物发光细菌也能被用来检测重金属。Petnen等[22]用PseudomonasfluorescensOS8(pTPT11)、Ps-eudomonasfluorescensOS8(pTPT31)分别检测汞和砷,得到了良好的效果(汞检测限达到0.003μg/kg)。

1.3免疫传感器

免疫传感器作为一种生物传感器,主要原理是依赖抗体与抗原(待检物)之间的高效特异性相互作用。随着对抗体结构和功能的逐步深入研究,将有助于稳定免疫传感器的性能。Lin等[23]将单克隆抗体固定在金纳米颗粒光纤探针上,用于结合Pb2+螯合物,引起局域化表面等离子体振荡信号的变化,实现检测Pb2+离子(检测限0.27μg/L,4℃、35d后仍可实现检测结果重现性)。Date等[24]将重金属离子(Cd2+、Cr6+、Pb2+)抗原微粒固定在固相支撑基质上,当待检物与金纳米颗粒标记抗体的混合物流经支撑基质时,剩余未与待检物结合的抗体可与固定抗原结合,实现竞争性间接检测待检物,检测信号与待检物浓度呈反比。该传感器检测时间短,7min内3种离子均可达到理论检测水平(抗体Kd限);检测效率高;采用微流控检测,可同时检测多种物质,有利于实现自动化控制操作等。

1.4DNA生物传感器

DNA生物传感器也被用于重金属离子的检测。Babkina等[25]用安培生物传感器检测了重金属离子与单链DNA的结合,检测限分别可以达到:1.0×10-10mol/LPb2+、1.0×10-9mol/LCd2+和1.0×10-7mol/LFe3+。Oliveira等[26]利用生物传感器对重金属离子(Pb2+、Cd2+和Ni2+)与双链DNA的相互作用进行了研究,指出二者相互结合能引起双链DNA结构的改变。Lan等[27]对体外试验中依赖金属离子的DNA酶(MetalIon-DependentDNAzymes)进行了研究,指出该酶对金属离子的特异性活性依赖性,可用于开发灵敏的重金属离子(Pb2+,Cu2+等)检测生物传感器。

1.5其他

光系统Ⅱ(PSⅡ)是多亚单位的色素和蛋白质的复合物,可以催化光引起的从水到质体醌的电子传递。这个复合物包括至少含有6个膜整合肽其中有捕获光能的复合体(LHCⅡ)等,见图2。光系统Ⅱ位于膜上,其色素、蛋白可与重金属离子相互作用,引起检测体系变化,并转换为可检测的信号,按照检测信号的不同可分为,安培计生物传感器和光学生物传感器两大类。对光合作用有影响的物质一般都对PSⅡ电子传递链有影响。目前认为重金属抑制光合作用是通过(1)抑制酶的作用,如原叶绿素酯还原酶、质体蓝素或Calvin循环中的一些酶;(2)重金属与蛋白质的疏水基团发生相互作用;(3)一些重金属(Hg2+、Cu2+、Cd2+、Ni2+和Zn2+)可以替代叶绿素分子中的Mg2+,从而抑制了光合作用;(4)重金属Cd2+、Cu2+对光合作用影响研究表明,Cd2+会引起PSⅡ中的D1蛋白结构破坏,从而影响PSⅡ的活性,而PSⅡ可能是Cu2+作用的目标[28]。基于此原理科学家开发了检测重金属离子的生物传感器。Bettazzi等[29]用一次性的丝网印刷类囊体膜电极,结合电化学方法检测重金属对光系统Ⅱ的抑制作用,可以检测到0.6mg/LCd2+的抑制效果。此外,一些蛋白质、肽类等物质也被用于开发检测重金属离子的生物传感器。Martinez-Neira等[30]报道了一种以运动蛋白质(伸缩蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白等)为基础的生物传感器,用以检测汞离子。HgCl2能够快速的抑制由肌动蛋白活化的肌球蛋白ATP酶的活性,从而抑制体外模拟的蛋白收缩。汞离子对于肌动蛋白丝运动性的抑制作用也可以直接观察到,这为生物传感器的开发提供了新的思路。Yin等[31]将牛血清蛋白固定在压电石英晶体胶体金表面质成生物传感器,通过压电石英晶体阻抗法检测铅离子。得到检测的线性范围为1.0×10-7-3.0×10-9mol/L,检测限1.0×10-9mol/L。Wu等[32]将金属硫蛋白固定在电极表面,通过表面等离子体共振(SPR)对Cd、Zn、Ni等进行检测。Bontidean等[33]报道了一种新的以合成的植物螯合肽(Glu-Cys)20Gly(EC20)为生物敏感元件的电容生物传感器来检测重金属离子(Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+),检测浓度范围100fmol/L-10mmol/L。该生物传感器可以贮存15d。Bontidean等[34]利用不同的生物传感器(蛋白、细菌细胞、植物)检测了土壤中生物可利用汞的含量。指出细菌细胞生物传感器和蛋白(融合蛋白GST-SmtA)生物传感器对于检测汞离子污染是有效的,植物传感器效果欠佳。

2展望

2.1不同生物敏感材料的比较

不同生物敏感材料对于重金属离子检测的作用效果有所不同,其本身性质也存在差异。各种酶作为生物传感器的组成成分,主要是依赖于重金属离子对酶的抑制作用,从而引起检测环境中反应物的相对变化进行检测。重金属对酶的抑制作用专一性相对比较广泛,因此在多种离子存在时,很难区分各自的种类和浓度。细胞生物传感器采用完整的细胞作为生物传感器的一部分,既有利于全面研究重金属离子对细胞的作用,也能通过保持细胞的自然状态提高细胞内各种生物分子的生物活性和稳定性。随着生物技术的不断发展,通过各种转基因和其他技术手段可以生产出各种具有某些特殊性质的工程菌类用于重金属检测,从而提高生物传感器对于某种特定重金属离子检测的专一性。其他生物材料也具有各自的优点,如蛋白质和多肽类物质可以通过改变pH值,影响其本身性质实现活性的恢复。免疫传感器用于重金属检测,因其分子量小,故与换能器信号检测联系密切。

2.2不同换能方式的比较

电化学、光纤、SPR、压电石英晶体以及机械运动形式的换能器都能作为生物传感器的组成部分用来检测重金属离子。但电化学和光纤应用的比较多,这可能与重金属离子与生物分子作用的形式有关,许多生物材料本身即具有发光性,便于光学检测。重金属离子的检测具有重要的意义,检测的准确性、灵敏性仍然需要提高。重金属污染广泛的存在于土壤、水等环境中,这就需要检测方法能够适应不同的检测对象、减小各种干扰物质的信号,并且能够便于野外定点测定。生物传感器检测方法自身所具有的优势使其具备了能同时满足这些条件的潜力。生物传感器的发展应该通过使用各种新技术尽可能提高自身的性能,克服生物质材料受环境因素影响大、不易保藏等缺点,并且发挥其易于自动化操作和小型化的优势,开发出实用性强的专门检测仪器。

作者:王明华 赵二劳 李杜娟 单位:忻州师范学院生物系 浙江大学生物系统工程与食品科学学院

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