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牛肠道病毒病原学特征及检测技术研究

 论文栏目:检测技术论文     更新时间:2017/10/12 9:19:29   

摘要:牛肠道病毒(BEV)感染是我国近年来的新发传染病,在牛群中普遍存在,且常与其他病原体发生混合感染和继发感染。本文介绍了牛肠道病毒的发现、形态及分类、流行病学特点等,阐述了该病毒检测技术的研究进展,如病毒的分离培养技术、血清学检测技术、分子生物学检测技术(RT-PCR技术和实时荧光定量RT-PCR技术)等,以期为预防和控制该病提供参考。

关键词:牛肠道病毒;病原学;检测;研究进展

牛肠道病毒(Bovineenterovirus,BEV)为小RNA病毒科、肠道病毒属,BEV感染临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻和繁殖障碍为主要特征。BEV感染在我国为新发传染病,在牛群中非常普遍,且常与其他病原体发生混合感染或继发感染,导致牛群出现较高的死亡率,对养牛业造成巨大的经济损失。因此,采取有效措施预防和控制BEV感染,对于确保养牛业的健康发展非常重要。本文概述了BEV的病原学特征及检测技术研究进展,以期为预防和控制该病病提供参考。

1病毒的由来和发现

BEV于1959年首次由Moll等[1]报道,之后也有在许多国家暴发与流行的报道。李英利等[2]从内蒙古发生腹泻的犊牛体内分离出1株BEV,分析发现该毒株为F种BEV,进而首次确认我国存在F种BEV感染。彭晓薇等[3]从北京市发生严重腹泻的泌乳奶牛中,分离获得F型BEV。侯佩莉等[4]经过一系列病毒鉴定,最终从泌乳奶牛的粪便中分离出1株F型BEV。邢泽黎等[5]从发病致死的肉牛体内分离得到E型BEV;张海丽等[6]从山西省发生严重腹泻的泌乳奶牛中,分离获得E型BEV。BEV多从发生严重呼吸道症状、消化道症状和繁殖系统障碍的病牛体内分离。BEV在44世界各国的牛群常见,感染率为17.6%~80%[7]。牛群感染后可引起下痢和呼吸道症状、食欲下降,严重的还会出现便血、产奶量大幅下降等症状。

2病毒的形态及分类

BEV的病毒粒子外观呈球形、正二十面体,无包膜,大小为25~30nm;病毒的基因组为不分节段的单股正链RNA,全长7.5kb。根据最新病毒分类,BEV与人脊髓灰质炎病毒、人柯萨奇病毒和猪肠道病毒等同属小RNA病毒科、肠道病毒属的成员。该属病毒包括A、B、C、D、E、F、G、H、J等9个肠道病毒种及A、B、C等3个鼻病毒种,其中肠道病毒E和F种属于BEV。E种包括E1~E4,F种包括F1~F6。

3病毒的流行病学特点

BEV感染符合肠道病毒属病毒感染的普遍规律:一种综合征可由不同肠道病毒所引起,同一种(型)肠道病毒可以导致不同综合征;单纯感染肠道病毒后,多数为表现亚临床症状(有超过90%的感染牛无症状),不易被发现;普遍分布于世界各地,感染广泛存在,并且常引起暴发;在环境中非常稳定,在不同的pH、温度、盐度等条件下能稳定存在。BEV的病原性并不明显,但由于其有时会侵犯其他器官,会导致临床上各种疾病综合征的出现。BEV的感染宿主较广,包括牛、羊、马、犬、羊驼等动物。

4病毒检测技术研究进展

4.1病毒分离培养技术

病毒分离与鉴定是检测BEV感染的金标准。实验室常采用MDBK细胞进行病毒分离试验。处理采集样品后,接种MDBK细胞培养,观察是否出现细胞病变(CPE),并对其核酸进行测序比对,确定是否存在BEV感染。病毒分离与鉴定是最可靠的检测方法,但费时长,操作繁琐,对技术人员要求高。

4.2血清学检测技术

Zhang等[8]建立了捕获ELISA方法来检测血清中的BEV抗体。该方法具有敏感性强、特异性高的特点,更重要的是比血清中和试验(SN)更经济。Zhang等[9]还建立了阻断ELISA方法来检测牛血清中的BEV抗体。该ELISA方法与传统SN法相比敏感高性,而且耗时短,可替代传统SN法用于大规模牧场的抗体检测。郭金玉等[10]利用北京市某牛场BEV-2型分离毒株的VP1蛋白,构建了检测BEV抗体的间接ELISA方法。该方法操作比较简单、快速、使用价值比较高。朱彤等[11]通过扩增BEV的VP2基因,对其进行了一系列的转化、诱导表达,纯化出重组蛋白,制备了较高效价的多克隆抗体,为BEV的血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研制奠定了基础。周萍萍[12]将纯化好的3D蛋白作为包被抗原,建立了BEV-3D-ELISA方法,应用该方法对哈尔滨市送检的425份奶牛血清进行了检测,发现阳性率高达41.41%。盖小春[13]应用表达纯化的E种BEVHY12VP2重组蛋白作为包被抗原,建立了检测E种BEV抗体的间接ELISA方法,对实验感染小鼠抗体消长规律进行了研究,为该病的免疫机理和疫苗研制打下基础。邢泽黎等[14]应用大肠杆菌表达纯化的E种BEVHY12的VP1和VP2重组蛋白制备了抗体,并建立了检测BEV病原的双抗体夹心ELISA方法,并对吉林省感染BE飞V牛群进行了病原流行病学调查,发现不同地区牛群的BEV感染率在8.16%~58.7%之间。双抗体夹心ELISA检测粪便中的BEV抗原的方法,可以快速、有效地确定牛群是否存在BEV感染,可为新发BEV感染的防控、牛群的净化提供有效的技术手段。

4.3分子生物学检测技术

4.3.1RT-PCR技术。Jimenez-Clavero等[15]针对BEV5´UTR基因建立了RT-PCR方法,并对西班牙的多个地区的牛、绵羊、山羊、驴、马以及地表水样进行了检测,结果发现除了在驴的检测样本中未检测到BEV外,其余均有阳性样本存在。Nathamon等[16]也根据5´UTR基因设计引物,建立了RT-PCR方法,并对泰国部分地区的本地牛、印度牛及山羊携带BEV的感染率进行了调查和分析,发现以上几种动物均有BEV的携带,其中本地牛的携带率最高(76%)。吴丹等[17]根据口蹄疫病毒(FMDV)和BEV基因的5´UTR保守基因区域分别设计引物,首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快检方法,对FMDV的最低检出限为8TCID50/0.1mL,对BEV的最低检出限为2TCID50/0.1mL。采用该方法检测852份临床样品,并与病毒分离方法比较,2种方法检测结果完全一致。侯佩莉等[18]针对BEV非结构蛋白3D基因设计引物,建立了RT-PCR方法,其敏感度高达10-1TCID50。侯佩莉等[19]根椐牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)和BEV基因的保守序列,设计合成引物,在建立单一病毒RT-PCR检测方法的基础上,优化条件,建立了上述3种病毒的多重RT-PCR方法,对24份临床腹泻病料进行检测,发现与单项RT-PCR的符合率为100%。该多重RT-PCR鉴别诊断方法对牛腹泻性疾病病因确诊、流行病学调查和防控具有重要意义。4.3.2实时荧光定量RT-PCR技术。吴丹等[20]根据5´UTR基因设计引物建立了检测BEV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,发现对BEV的最小检测量为0.1TCID50/0.1mL,对采集自北京周边地区牛群的852份临床样本进行了检测,且与分离病毒法进行了敏感性比较,结果发现该方法检出阳性样本与病毒分离法检出的一致,但敏感性比病毒分离法高10倍。朱彤等[21]根据BEV3D基因设计引物建立了检测BEV的SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法,发现其敏感度达7.13×101拷贝/µL,是常规RT-PCR检测值的10倍。应用该方法检测了3个规模化奶牛场送检的41份奶牛腹泻样本和3份气溶胶样本,发现腹泻样品阳性检出率为39.02%(16/41),3份气溶胶样本均为阳性。本研究建立的SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR检测方法具有特异、稳定、高效的优点,既可以用于临床检测,又可对环境中的BEV进行动态监测,为BEV流行病学调查、诊断提供了有力的技术支持。

5小结

BEV感染在世界范围内流行。由于其所引起的临床症状与其他病原体(BVDV、BCoV等)所引起的疾病症状非常相似,仅从临床上进行诊断很容易造成误诊,致使病情加重,甚至威胁到生命安全。及早确诊所感染的病毒及类型,对于及时扑灭疫情,控制疫病的传播具有重要作用。目前,我国对牛肠道疾病的研究主要集中在诊断方面,而在防治方面还很薄弱,尚无特效治疗药物及疫苗预防,因此建立完善该病的诊断技术及研发疫苗对我国奶牛养殖业将具有重大意义。

作者:庄金秋 梅建国 刘吉山 张颖 杨丽梅 沈志强 单位:山东省滨州畜牧兽医研究院

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